鼻咽癌肿瘤的抗原研究论文(共2篇) 

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鼻咽癌肿瘤的抗原研究论文(共2篇)

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第1篇:探讨阻断mTOR信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用机制

目前,越来越多的证据显示肿瘤干细胞(,CSCs)会导致肿瘤复发和转移以及对放化疗不敏感,因此针对肿瘤干细胞的治疗是成功治愈肿瘤的关键。我们的前期研究发现在人原代鼻咽癌细胞中也存在类肿瘤干细胞,同时mTOR信号通路呈激活状态,用免疫组织化学双染技术证实这些异常活化的细胞中上皮干细胞标记物可选择性的共表达,并且用雷帕霉素可抑制鼻咽癌肿瘤细胞的增殖〔-2〕。因此我们可以假设鼻咽癌类肿瘤干细胞中雷帕霉素耙蛋白(mTOR)通路较鼻咽癌细胞异常激活,雷帕霉素可以通过下调mTOR信号通路下游活性蛋白的表达而抑制鼻咽癌类肿瘤干细胞的增殖。本研究采用无血清培养法富集类肿瘤干细胞,并鉴定其干细胞特性,验证mTOR信号通路在类肿瘤干细胞及鼻咽癌细胞中的表达差异,并观察雷帕霉素在抗类肿瘤干细胞中的作用,初步探讨阻断mTOR信号通路抑制鼻咽癌肿瘤干细胞的作用机制。

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1材料与方法

材料细胞鼻咽癌细胞株CNE2由南方医科大学肿瘤研究所惠赠。

主要试剂胎牛血清、RPMI-1640培养液、培养液、B27C1:50)、均购自GIBCO公司,EGF、bFGF购自公司,mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、、CD44、SOX2购自Cellsignaling公司,OCT4、Ramapycin购自Sigma公司,GAPDH购自公司,HRP标记的二抗为Biosharp公司,CCK8购自Dojindo公司。

主要试剂配制①含血清培养液:培养液45ml加胎牛血清5ml加青霉素100U/ml加链霉素100g/L,摇匀,冷藏备用;②无血清培养液:培养液49ml力口bFGF20啤/L力口EGF力卩B271ml摇匀,冷藏备用。 实验方法细胞的普通培养复苏CNE2鼻咽癌细胞于含血清培养液中,37°C、5%CO2培养箱培养,至细胞处于对数生长期时,%胰蛋白酶消化、传代。 鼻咽癌细胞类肿瘤干细胞的无血清富集培养取对数生长期普通培养之CNE2细胞,胰蛋白酶消化完全离心后,PBS洗涤2次,加入无血清培养液,调整细胞密度1X108/L于6孔板中,振荡,5%CO2、37°C饱和湿度培养。2d后半量换液,悬浮培养第5天后低

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数离心细胞悬液收集肿瘤球细胞。

鼻咽癌肿瘤球细胞的干细胞特性鉴定及mTOR信号通路的变化①CCK8法检测细胞增殖。将无血清培养收集的CNE2肿瘤球细胞及将对数生长期的贴壁CNE2细胞分别接种到96孔板中,每种细胞种6孔,每孔5000个细胞,每孔中加含10%胎牛血清的RPMI-1640培养液,37°C,5%CO2培养箱中培养。分别在培养的第1、3、5、7天向每孔加入10ul的CCK8溶液,继续孵育1h,用自动酶标仪(450nm波长)测吸收度数值,绘制2组细胞的生长曲线。

检测干细胞标记物蛋白和mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达。收集CNE2及肿瘤球细胞,用的PBS洗涤细胞3次,离心,弃上清,加入含10%磷酸酶抑制剂、1%PMSF的RIPA裂解液,超声裂解3次,冰上放置30min,4C、离心15min,收集分装上清液,BCA法测蛋白浓度。30ug蛋白上样,以10%的聚丙烯酰胺(SDS-FAGE)凝胶电泳分离蛋白后转至PVDF膜上,室温下由5%脱脂奶粉配制的封闭溶液中封闭2h,摇床均匀震荡,一抗CD44、SOX2、OCT4、mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、均为1:500)4°C过夜,加入相应二抗(1:5000)室温摇床孵育2h,洗膜后以ECL试剂发光,检测目的蛋白条带,X-ray胶片

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曝光,结果用软件分析,以内参GAPDH表达情况作为内对照校正,目的蛋白相对表达量用目的条带值与内参比值表示,实验重复3次。

法测不同浓度雷帕霉素对鼻咽癌肿瘤球细胞及CNE2细胞抑制率的差异收集CNE2及肿瘤球细胞,分别用100ul含血清和无血清培养液接种于96孔板中,每孔5000个细胞,每孔中添加不同浓度雷帕霉素10ul,浓度梯度依次为:、、、、/L,每组设3个复孔,37°C,培养箱中培养,48h后加CCK8溶液10l继续孵育1h,用自动酶标仪(450nm波长)测吸收度值(A),计算各细胞存活率(%)=(加药组A-空白组A)/(未加药组A-空白组A)X100%,计算2组细胞的半数抑制率浓度。

检测雷帕霉素作用肿瘤球细胞后mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达收集CNE2肿瘤球细胞1X106个,分别以0、20、50、100nmol/L不同浓度雷帕霉素作用,37°C,5%CO2培养箱中培养48h后,用Westernblot检测mTOR、P-mTOR、P70S6、P-P70S6、4EBP1、的表达,实验重复3次。

统计学处理方法采用统计软件处理分析数据,实验数据以尤士s表示,两样本均数比较采用f检验,多组间均数比较采用单因素方差分析,进一步多重比

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较采用LSI>(检验。以P。见图2。

比较CNE2与鼻咽癌肿瘤球细胞(被认为是肿瘤干细胞CSCs)在mTOR及其信号通路下游相关蛋白的表达差异方面,Westernblot检测结果显示,在mTOR、P70S6、4EBP1的表达上,两者差异无统计学意义,而在各自活化的磷酸化水平的表达上,成球细胞较CNE2表达较高,均差异有统计学意义。以、、、、浓度雷帕霉素对鼻咽癌肿瘤球细胞(认为是及CNE2细胞作用48h后,CCK8法测各自细胞存活数量,计算存活率,雷帕霉素对CNE2及CSCs的增殖均有抑制作用,并表现出一定的剂量依赖性,而比较两者的半数抑制率发现,CSCs的半数抑制率浓度为/L,而CNE2的半数抑制率浓度为/L,雷帕霉素对CSCs更加敏感。雷帕霉素作用肿瘤球细胞后m丁OR及其信号通路下游相关蛋白的表达以0、20、50、浓度雷帕霉素作用肿瘤球细胞(认为是后,用Westernblot检测相关蛋白表达,以0组做对照,LSI>f检验结果显示,随着雷帕霉素浓度的递增,CSCs中mTOR及其信号通路下游蛋白P70S6、4EBP1的表达与对照组比较差异无统计学意义,而在其活化水平P-mTOR、P-P70S6、上的表达呈递减趋势,与对照组比较均差异有统计学意义(20nmo/L浓度时P-P70S6除外)。

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